Teknik Desain Primer

Primer merupakan komponen PCR yang sangat menentukan akurasi sekuen DNA yang ingin diamplifikasi. Urutan nukleotida primer akan menjadi penentu pada bagian mana primer akan menempel (anneal) pada genom. Jika urutan nukleotidanya tidak sesuai dengan kode gen yang kita inginkan, dapat dipastikan produk PCR yang dihasilkan akan keliru. Oleh sebab itu, sebelum melangkah pada tahap amplifikasi dengan PCR, primer yang akan digunakan harus dipastikan dahulu spesifitasnya. Caranya ialah dengan membuat desain primer.

Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis, yakni forward dan reverse. Forward primer bergerak dengan arah  5′ –> 3′ untai DNA template. Sementara reverse primer bergerak dengan arah 3′ –> 5′ untai DNA template. Kedua primer ini dapat didesain dengan mengunakan program aplikasi yang terdiri dari BIOEDIT, GENAMICS EXPRESSION, OLIGOCALCULATOR, dan FAST PCR. Untuk memahami cara kerjanya, berikut ini saya contohkan langkah mendesain primer untuk gen selulase pada Bacillus subtilis atau bglC.

1. Menentukan posisi bglC dalam  whole genom Bacillus subtilis.

2. Mencari tahu enzim restriksi yang tidak memotong sekuen gen dengan  menggunakan program  aplikasi BIOEDIT.

3.  Memilih enzim restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan mempelajari peta sirkuler dan situs pemotongan pET-21b. Restriksi yang sesuai dengan pET-21ialah NdeI, NheI, BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI, XhoI, EagI, AvaI,

4. Menentukan posisi forward primer dan reverse primer dengan Genamics Expresion. Posisi primer diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon serta mengarah ke situs pemotongan enzim restriksi.

Keterangan: Data sumber gen selulase diperoleh B.subtilis str. DLG

5. Jika situs pemotongan enzim restriksi di dekat start dan stop kodon sulit disesuaikan dengan posisi primer, dapat dilakukan mutasi situs pemotongan pada  2-3 nukleotida. Mutasi 2-3 nukleotida pada sekuen gen selulase tidak akan mengurangi daya lekat primer  terhadap untai DNA asalkan presentase Guanin (G) dan Sitosin (C)  primer cukup tinggi.

6. Mengecek desain primer dengan Primer Calculator (pada Genamics Expression) dan atau dengan Oligocalculator.

contoh tampilan:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Hasil oligo shelf complimentary untuk reverse primer

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. Mengecek desain primer dengan Fast PCR untuk mengetahui tingkat spesifitas primer dan ukuran produk PCRnya.

Selamat Mendesain Primer mu!!

(Catatan: Desain primer yang ditunjukan pada masing-masing gambar tidak sama karena diambil penulis dari data berbeda. Tapi Insya Allah, setiap gambar cukup mewakili proses yang disebutkan.)

Iklan

6 Komentar

  1. lumayan byk membantu

  2. terima kasih mbak ais, tulisanya dapat untuk belajar….

  3. Ok, Rina. Semoga bermanfaat yah…
    (kalau ada kekeliruan, mohon dikoreksi..)
    ^-^V

  4. terimakasih mbk…..boleh nanyak gag mbk, apa mbk pernah riset ttg design primer? primer calculaor atau oligocalculator itu apa sebuah situs web, seperti BLAST gene??

  5. @gading
    wah maaf baru bales nih. semoga masih berguna jawabannya.
    iya, saya pernah berurusan dengan desain primer. walaupun pada akhirnya desain primer saya dikoreksi sama pendamping penelitian saya.hehe.
    primer calculator itu terdapat pada program aplikasi genamic expression. donlot aja. kalo gak salah di blog ini aku sediakan linknya. cek “downloads”.
    kalo oligo calculator bisa langsung dikunjungi di website. ketikan saja “oligo calculator”. mbah google pasti tau.
    =)

  6. wah informasinya bagus mbak,
    boleh nanya mbak, saya kan masih asing terkait desain primer, yang saya tanyakan, setelah kita selesai mendesain primer kemudian cara kita membuat primernya itu bagaimana mbak, ,
    trima kasih.


Comments RSS TrackBack Identifier URI

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s