Isolasi Genom Bakteri Gram Positif

Teknik kerja isolasi genom secara umum terdiri dari tiga tahap, yakni pemanenan pelet, pelisisan sel bakteri untuk  mendapatkan DNA, pemisahan dan pemekatan DNA.

Gambar 1 menjelaskan tentang teknik pemanenan pelet. Tahap ini ditujukan untuk mendapatkan pelet yang terpisah dari media pertumbuhannya. Pelet ditimbang pada kisaran tertentu yang disesuaikan dengan konsentrasi lisozim dalam pelisisan sel. Konsentrasi lisozim yang digunakan ialah 6 mg/200 mL TE. Massa pelet yang efektif dilisis dengan konsentrasi demikian berkisar antara 20-30 mg.

Gambar 2 menjelaskan tentang teknik pelisisan sel bakteri positif untuk  mendapatkan DNA. Bahan-bahan yang harus disiapkan antara lain TE-lisozim, lisis solution, cold chloroform, precipitation solution, ddH2O dan pelet sel yang diperoleh dari tahap sebelumnya. Pelisisan sel bakteri Gram positif, seperti B.subtilis, memerlukan perlakuan khusus karena memiliki dinding sel yang tebal. Pemberian TE-lisozim pada pelet akan mencerna dinding sel bakteri. Homogenisasi atau vorteks setelah pemberian lisozim harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif.

Preparasi TE-lisozim dan precipitation solution disajikan pada tabel dibawah ini,

Tabel 1. Komposisi TE-Lisozim


Tabel 2. Komposisi Precipitation solution


Gambar 3 menjelaskan pemisahan dan pemekatan DNA. Pemisahan dan pemekatan DNA ditujukan untuk memurnikan DNA dari senyawa pengotor yang menyertainya selama isolasi. Bahan-bahan yang dibutuhkan antara lain NaCl 1,2 M solution, EtOH pekat (96 %), EtOH 70%, RNAse 30 μl. EtOH 96 % cold berfungsi untuk mengendapkan DNA plasmid dan untuk membilas dan mencuci plasmid.

Penambahan garam NaCl 1,2M berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan – (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan +pada H dan – pada O), atau dapat dikatakan air memiliki konstanta dielektrik yang tinggi. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol ialah menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi (Pradhika, 2008).

Tips kerja: Enzim dalam air liur dan keringat dapat mendegradasi  DNA.  Jadi, selama bekerja dengan menggunakan DNA berdisiplinlah untuk meminimalisasi pembicaraan, menggunakan masker dan sarung tangan karet agar bahan yang kita ujikan aman.

Iklan

Tinggalkan komentar

Belum ada komentar.

Comments RSS TrackBack Identifier URI

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s