Tips mencampurkan bahan-bahan PCR pada tube

Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mencampurkan bahan-bahan PCR, antara lain sebagai berikut:

1. Semua bahan harus diletakan secara terpisah pada dinding tube, kecuali akuades. Hal ini dilakukan untuk menghindari pencampuran bahan sebelum kondisi PCR dioptimasi/ diatur.

2. Bahan-bahan yang terdiri dari DNA template, MgCl2, Taq buffer, dNTP’s, dan Taq polimerase dapat dicampurkan dalam dinding tube selama preparasi bahan PCR.

3. Forward primer dan reverse primer harus diletakan agak berjauhan.

4. Akuades dapat diletakan di dasar tube.

Iklan

Isolasi Genom Bakteri Gram Positif

Teknik kerja isolasi genom secara umum terdiri dari tiga tahap, yakni pemanenan pelet, pelisisan sel bakteri untuk  mendapatkan DNA, pemisahan dan pemekatan DNA.

Gambar 1 menjelaskan tentang teknik pemanenan pelet. Tahap ini ditujukan untuk mendapatkan pelet yang terpisah dari media pertumbuhannya. Pelet ditimbang pada kisaran tertentu yang disesuaikan dengan konsentrasi lisozim dalam pelisisan sel. Konsentrasi lisozim yang digunakan ialah 6 mg/200 mL TE. Massa pelet yang efektif dilisis dengan konsentrasi demikian berkisar antara 20-30 mg.

Gambar 2 menjelaskan tentang teknik pelisisan sel bakteri positif untuk  mendapatkan DNA. Bahan-bahan yang harus disiapkan antara lain TE-lisozim, lisis solution, cold chloroform, precipitation solution, ddH2O dan pelet sel yang diperoleh dari tahap sebelumnya. Pelisisan sel bakteri Gram positif, seperti B.subtilis, memerlukan perlakuan khusus karena memiliki dinding sel yang tebal. Pemberian TE-lisozim pada pelet akan mencerna dinding sel bakteri. Homogenisasi atau vorteks setelah pemberian lisozim harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif.

Baca lebih lanjut

Peremajaan dan Preparasi Kultur E.coli DH5α Hasil Transformasi untuk isolasi plasmid

Sebelum melakukan isolasi plasmid, ada bahan penting yang harus kita siapkan minimal sehari sebelum kerja. Apakah itu? Yupz, kultur mikroba transforman. Pada teknik transformasi yang pernah saya kerjakan, saya menggunakan E.coli DH5α sebagai sel kompeten dalam kloning. So, yang akan kita siapkan untuk isolasi plasmid ialah kultur hasil transformasi pada E.coli DH5α.  Berikut ini teknis kerjanya:

Peremajaan dan Preparasi Kultur E.coli DH5α Hasil Transformasi untuk isolasi plasmid

Isolasi Plasmid pada Transforman yang membawa pG-xynA

Isolasi plasmid diawali dengan screening koloni putih-biru pada media Amp+X-gal+IPTG. Positive clone pG-xynA yang membentuk koloni berwarna putih pada media selektif Amp+X-gal+IPTG direkultur ke media cair Luria Berthani. Setelah inkubasi 1×24 jam pada temperatur ruang, hasil rekultur diambil sebanyak 1,5 ml untuk isolasi plasmid, sedangkan sisanya dibuat stok gliserol. Setelah stok transforman tersedia, disiapkan bahan-bahan yang akan digunakan dalam isolasi plasmid. Bahan-bahan yang dapat disiapkan lebih awal antara lain solution I, dan solution III. Mix TE-RNAse, mix enzim restriksi, dan solution II harus disiapkan sesaat sebelum digunakan atau freshly prepared karena bahan-bahan tersebut sangat peka terhadap perubahan temperatur.

Berikut ini komposisi bahan-bahan yang saya gunakan ketika PKL  di Laboratorium CBRG, LIPI Bioteknologi.

 

 

 

 

 

 

Ket: 1unit enzim dapat memotong 1 μg/jam.
Mix enzim restriksi untuk 1x reaksi = 1,0  µl untuk sampel sebanyak 4 µl.

 

 

 

Setelah bahan-bahan yang dibutuhkan tersedia, isolasi plasmid bisa segera dilakukan.

urutan kerja isolasi plasmid

Jika hasil elektroforesis menunjukkan 2 pita di ukuran 3018 bp (ukuran pGEM-T Easy) dan 1266 bp (ukuran gen xynA) ligasi dinyatakan berhasil.

–Gimana? Agak rebet kah? atau justru mudah? Well, untuk mengerjakan aktivitas Lab yang berkaitan dengan bahan-bahan supersensitif seperti DNA dkk perlu kesabaran tinggi. Karena seringkali meski kita sudah berhati-hati, adaaa saja yang membuat si benda kecil tersebut gag mau nongol saat elektroforesis. Kalau ini terjadi, tetep semangat yah!!! JANGAN MENYERAH…….

Aza aza fighting!!!—