Teknik Desain Primer

Primer merupakan komponen PCR yang sangat menentukan akurasi sekuen DNA yang ingin diamplifikasi. Urutan nukleotida primer akan menjadi penentu pada bagian mana primer akan menempel (anneal) pada genom. Jika urutan nukleotidanya tidak sesuai dengan kode gen yang kita inginkan, dapat dipastikan produk PCR yang dihasilkan akan keliru. Oleh sebab itu, sebelum melangkah pada tahap amplifikasi dengan PCR, primer yang akan digunakan harus dipastikan dahulu spesifitasnya. Caranya ialah dengan membuat desain primer.

Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis, yakni forward dan reverse. Forward primer bergerak dengan arah  5′ –> 3′ untai DNA template. Sementara reverse primer bergerak dengan arah 3′ –> 5′ untai DNA template. Kedua primer ini dapat didesain dengan mengunakan program aplikasi yang terdiri dari BIOEDIT, GENAMICS EXPRESSION, OLIGOCALCULATOR, dan FAST PCR. Untuk memahami cara kerjanya, berikut ini saya contohkan langkah mendesain primer untuk gen selulase pada Bacillus subtilis atau bglC.

1. Menentukan posisi bglC dalam  whole genom Bacillus subtilis.

2. Mencari tahu enzim restriksi yang tidak memotong sekuen gen dengan  menggunakan program  aplikasi BIOEDIT.

3.  Memilih enzim restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan mempelajari peta sirkuler dan situs pemotongan pET-21b. Restriksi yang sesuai dengan pET-21ialah NdeI, NheI, BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI, XhoI, EagI, AvaI,

4. Menentukan posisi forward primer dan reverse primer dengan Genamics Expresion. Posisi primer diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon serta mengarah ke situs pemotongan enzim restriksi.

Keterangan: Data sumber gen selulase diperoleh B.subtilis str. DLG

5. Jika situs pemotongan enzim restriksi di dekat start dan stop kodon sulit disesuaikan dengan posisi primer, dapat dilakukan mutasi situs pemotongan pada  2-3 nukleotida. Mutasi 2-3 nukleotida pada sekuen gen selulase tidak akan mengurangi daya lekat primer  terhadap untai DNA asalkan presentase Guanin (G) dan Sitosin (C)  primer cukup tinggi.

6. Mengecek desain primer dengan Primer Calculator (pada Genamics Expression) dan atau dengan Oligocalculator.

contoh tampilan:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Hasil oligo shelf complimentary untuk reverse primer

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. Mengecek desain primer dengan Fast PCR untuk mengetahui tingkat spesifitas primer dan ukuran produk PCRnya.

Selamat Mendesain Primer mu!!

(Catatan: Desain primer yang ditunjukan pada masing-masing gambar tidak sama karena diambil penulis dari data berbeda. Tapi Insya Allah, setiap gambar cukup mewakili proses yang disebutkan.)

Iklan

Cara Menelusur Sekuen Whole Genom Bakteri (contoh: Bacillus subtilis)

1. Masuk ke homepage NCBI,
2. BLAST,
3. NUCLEOTIDE BLAST (n-blast),

masuk BLAST
4. Masukan sekuen gen lengkap yang sudah kita punya ,
(tunggu hingga muncul opsi sumber penelusuran whole genom)
5. Pilih NCBI genom,
6. Klik Blast,
(muncul opsi nama-nama spesies yang wholem  genomnya telah berhasil disekuensing)
7. Pilih Bacillus subtilis,
(muncul hasil)

Tampilan Grafik Sekuen Nukleotida bglC
8. Klik kode genom: NC_000964,
9. Sekuen whole genom diperoleh,
10. Atur dalam format FASTA, lalu salin dalam notepad.